百日咳毒素（pertussis toxin）誘導不同動物多發(fā)性硬化模型的比較
 

作者：陸正齊， 朱燦勝， 鄭雪平， 王敦敬， 胡學強 作者單位：中山大學附屬第三醫(yī)院神經(jīng)病學科， 廣東 廣州

　　【摘要】 【目的】 研究不同抗原和不同動物的多發(fā)性硬化動物模型的神經(jīng)功能損害和病理特點。【方法】分別用MOG 35-55免疫C57BL/6小鼠建立小鼠EAE模型，以豚鼠脊髓勻漿為抗原致敏DA大鼠建立大鼠EAE模型，用同源猴腦白質(zhì)勻漿免疫食蟹猴建立非人靈長類EAE模型;分別用不同的神經(jīng)功能評分標準評價EAE的神經(jīng)功能缺失，用HE染色觀察炎癥細胞浸潤，砂羅鉻花青法（solochrome cyanin）或LBF染色觀察髓鞘脫失情況，用改良的Bielschowsky法染色觀察軸突損傷;用透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)改變。 【結(jié)果】 用不同的抗原如MOG 35-55乳化液、豚鼠脊髓勻漿和同源猴腦白質(zhì)勻漿均能成功制作EAE模型，發(fā)病率為100%，其中豚鼠脊髓勻漿誘導的DA大鼠EAE動物模型為急性模型，病情恢復快，炎癥反應重，脫髓鞘輕微;用MOG 35-55乳化液制作C57BL/6小鼠EAE模型為慢性進展模型，炎癥反應輕，脫髓鞘和軸突損傷明顯，是MS的模型。用同源猴腦白質(zhì)勻漿致敏的EAE食蟹猴有急性病程的，有復發(fā)的，有慢性進展型的，脫髓鞘和軸突變性明顯。 【結(jié)論】 不同抗原和不同動物的EAE模型無論從病程、神經(jīng)功能評分和病理改變方面均有自己的特點。用MOG 35-55乳化液制作C57BL/6小鼠EAE模型是MS的模型。

　　【關(guān)鍵詞】 多發(fā)性硬化; 實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎; 動物模型

　　Comparison of Various Animal Models of Multiple Sclerosis Induced by Different Antigens on Different Animals

　　LU Zheng-qi， ZHU Can-sheng， ZHENG Xue-ping， WANG Dun-jing， HU Xue-qiang

　　（ Department of Neurology， The Third Affiliated Hospital of SUN Yat-sen University， Guangzhou 510630， China ）

　　Abstract： 【Objective】 To compare neurofunctional impairment and pathological features of various animal models of multiple sclerosis （MS）-experimental autoimmune encephalomyelitis （EAE）-induced by different antigens on different animals. 【Methods】 C57BL/6 mice EAE model， DA rat EAE model and cynomolgus monkeys EAE model were induced by MOG 35-55 peptide， guinea pig spinal cord homogenate （GPSCH） and cerebral white matter homogenate （CWMH） emulsified with complete Freund′s adjuvant （CFA）， respectively. Neurofunctional scores were recorded. Tissues were sectioned and stained with hematoxylin and eosin （HE） for revealing inflammatory infiltrates. Solochrome cyanin technique or Luxol fast blue staining was used for myelin staining， and Bielschowsky′s staining for axonal damage. Ultrastructure was observed by electronic microscope. 【Results】 EAE models were successfully induced by all methods mentioned above. The morbidity of all the experimental animals was 100%. However， C57BL/6 mice EAE model immunized with MOG 35-55 peptide was chronic and progressive， with mild inflammation， obvious demyelination and axonal loss. DA rat EAE model was acute， with severe inflammation and mild demyelination. Cynomolgus monkeys EAE model was versatile， with acute， chronic relapsing and progressive course and the inflammatory infiltration and demyelination of brain was obvious. 【Conclusion】 These data may indicate that neurofunctional scores and pathological features could be distinctive of various EAE models induced by different antigens on different animals. C57BL/6 mice EAE model immunized by MOG 35-55 peptide emulsified with CFA could be an ideal model of MS.

　　Key words： multiple sclerosis; experimental autoimmune encephalomyelitis; animal model

　　[J SUN Yat-sen Univ（Med Sci），2008，29（6）：684-689]

　　實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）是由同種型、同種異型、異種異型致腦炎抗原誘導的、實驗敏感動物產(chǎn)生的、由細胞免疫反應介導的、以CNS白質(zhì)脫髓鞘為特征的遲發(fā)性變態(tài)反應性自身免疫疾病[1]。根據(jù)致敏原的組成、致敏的方法和動物的遺傳背景的不同，可誘導出超急性、急性、慢性臨床和病理特點的EAE。其中慢性復發(fā)性EAE與多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）極相似，是MS的模型。可是，我國目前許多學者誘發(fā)的模型死亡率高，發(fā)病率低，炎癥反應重，而脫隨鞘不明顯，不能代表臨床上的MS。我課題組15年來一直從事EAE的制作和研究，下面介紹我科用不同抗原以誘導及不同動物EAE的病情和病理特點。

　　1 材料與方法

　　1.1 用MOG 35-55乳化液制作C57BL/6小鼠EAE模型

　　1.1.1 實驗材料 C57BL/6小鼠，雌性6 ～ 8周C57BL/6小鼠14只，體質(zhì)量16 ～ 20 g。動物來源于中山大學動物實驗中心。MOG 35-55購于加拿大Sheldon 生物技術(shù)中心。百日咳毒素購于上海起福生物科技有限公司

　　1.1.2 C57BL/6小鼠EAE模型建立 EAE模型建立參照Zappia等[2]報道的方法。簡述如下：所有動物兩側(cè)腹股溝上方皮下注射0.1 mL的MOG 35-55乳化液，其中MOG 35-55 100 μg，*Freund′佐劑（CFA）500 μL，其中含500 μg滅活的分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis），每只動物在免疫的當天和48 h后腹腔注射400 ng的百日咳毒素（pertussis toxin） 。

　　1.1.3 C57BL/6小鼠EAE病情評分 C57BL/6小鼠EAE病情評分標準采用Pluchino等[3]報道的方法，標準如下：1級，部分尾巴下垂; 2級，*尾巴下垂; 3級，*尾巴下垂和站立行走緩慢; 4級，后肢部分癱瘓; 5級，后肢*癱瘓; 6 級，瀕死狀態(tài)。

　　1.1.4 病理檢查 于發(fā)病后10 d取3只動物，先用40 g/L的多聚甲醛心內(nèi)灌注，快速處死，取脊髓的腰骶段，再用多聚甲醛后固定，切成石蠟切片，切片厚度5 ～ 6 μm，4 ℃保存。HE染色[4]：用以觀察炎癥變化，評分標準[2]：0分，沒有炎性細胞;1分，少數(shù)散在的炎性細胞;2分，炎性細胞聚集浸潤在血管的周圍;3分，廣泛的血管套形成，并延伸入鄰近實質(zhì)區(qū)域，或?qū)嵸|(zhì)區(qū)域的浸潤而無明顯的血管套形成。砂羅鉻花青法[4]（solochrome cyanin）：用來觀察髓鞘脫失情況，評分標準如下[2]：1分，軟脊膜下少量脫髓鞘改變; 2分，軟脊膜下和血管周明顯的脫髓鞘;3分，軟脊膜下或血管周圍脫髓鞘斑塊融合; 4分，軟脊膜下和血管周圍廣泛的脫髓鞘累及一半的脊髓，并伴有CNS實質(zhì)內(nèi)炎性細胞的浸潤; 5分，廣泛的軟脊膜下和血管周脫髓鞘累及整個脊髓橫斷面，伴有CNS實質(zhì)內(nèi)的炎細胞浸潤。軸突染色：用改良的Bielschowsky法[4]染色觀察軸突變性。

　　1.2 用豚鼠脊髓勻漿為抗原致敏DA大鼠EAE動物模型

　　1.2.1 實驗動物 Dark Agouti（DA）大鼠，雌性8 ～ 10周，10只，體質(zhì)量250 ～ 300 g。動物來源于中山大學動物實驗中心。

　　1.2.2 抗原佐劑乳化物的制備 以豚鼠脊髓勻漿（Guinea pig spinal cord homogenate，GPSCH）與弗氏*佐劑（complete Freund adjuvant，CFA）均勻混合作為抗原佐劑乳化物。豚鼠以戊巴比妥鈉麻醉后（50 mg/kg，腹腔注射），以預冷的冰生理鹽水心臟灌注至右心房流出液清亮時，小心取出豚鼠脊髓，挑去脊膜及血管，稱質(zhì)量，加等量的*弗氏佐劑（CFA），用注射器反復抽打，制成油包水狀態(tài)，即成抗原佐劑乳化物。

　　1.2.3 DA大鼠EAE動物模型建立 DA大鼠尾根部皮膚常規(guī)消毒后，進行單點皮下注射抗原佐劑乳化物0.2 mL。正常對照組動物注射同等劑量CFA + 生理鹽水。免疫當日及免疫后所有動物每日觀察大鼠飲食、活動情況，并稱量體質(zhì)量。

　　1.2.4 DA大鼠EAE動物模型神經(jīng)功能評分 評分標準采用Reynolds等[5]報道的方法，標準如下：0分，無明顯異常;1分，尾巴無力松弛;2分，行動遲緩，輕度共濟失調(diào);3分，后肢無力;4分，后肢麻痹;5分，四肢麻痹或死亡。

　　1.2.5 病理檢查 于發(fā)病后10 d取5只動物，先用40 g/L的多聚甲醛心內(nèi)灌注，快速處死，取腦和脊髓，再固定，切成石蠟切片，切片厚度5 ～ 6 μm，4℃保存。HE染色：同前。LBF髓鞘染色： Luxol fast blue（LBF） 染色[5]觀察髓鞘脫失情況。

　　1.3 用同源猴腦白質(zhì)勻漿制作食蟹猴EAE模型

　　1.3.1 實驗動物 食蟹猴，雌性6 ～ 10月，10只，體質(zhì)量2.5 ～ 3.0 kg。動物來源于廣東省靈長類動物實驗中心。

　　1.3.2 抗原佐劑乳化物的制備 健康食蟹猴腦，新鮮無菌保存于零下70 ℃度，在18 ℃下去灰質(zhì)，按體質(zhì)量/體積 = 1/1.5將猴腦白質(zhì)加PBS，制成猴腦白質(zhì)勻漿，按體積/體積 = 1/1加CFA，用注射器反復抽打，制成油包水狀態(tài)，即成抗原佐劑乳化物。

　　1.3.3 食蟹猴EAE動物模型的建立 致敏實驗動物產(chǎn)生EAE的途徑有皮下、皮內(nèi)、肌肉、腹腔和靜脈注射多種途徑，經(jīng)大量動物試驗研究證實皮下多部位注射致敏原誘導EAE的發(fā)生率zui高。我們采取腋窩和腹股溝皮下注射免疫動物每處注射0.2 mL，每次3 ～ 4處。5～7 d后重復注射一次。

　　1.3.4 EAE的病情分級標準 猴EAE的臨床病情分級標準參照Massacesi 等[7]報告的猴EAE臨床病情評分方法，分為6級：0級，正常;1級，嗜睡、厭食及體質(zhì)量下降;2級，共濟失調(diào)、震顫;3級，視力下降、偏癱及截癱;4級，四肢癱;5級，瀕死狀態(tài)。

　　1.3.5 EAE的病理檢查 我們對發(fā)病后10 d的EAE猴進行尸解。取猴腦和脊髓，一側(cè)腦-70 ℃保存，一側(cè)用40 mL/L的甲醛溶液固定6 h， 流水沖洗后，從矢狀竇將腦切成兩半，然后按冠狀面分別將額、顳、頂、枕、小腦、腦干、脊髓切成0.5 cm 厚的組織塊，按常規(guī)方法脫水、透明、浸潤、包埋、制成蠟塊。染色方法：用HE常規(guī)染色[4]觀察炎癥變化，用砂羅鉻花青染色法觀察髓鞘變化。電鏡切片制作與觀察[8]：迅速將新鮮切取的修整成1 mm × 1 mm × 1 mm大小的組織塊置于25 g/L的戊二醛和20 g/L多聚甲醛前固定液中作固定3 h以上，取出后，以后固定1.5 h，梯度酒精脫水，環(huán)氧樹脂Epon812包埋，AO型超薄切片機切片，醋酸鈾及檸檬酸鉛雙染，zui后用日立H-600透射電鏡觀察。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 C57BL/6小鼠EAE病情變化

　　所有動物100%發(fā)病（14/14），平均發(fā)病時間（14.3 ± 1.5） d， 平均病情評分（2.6 ± 0.8）分，zui大病情評分（3.9 ± 1.5）分，病情恢復較慢，為慢性進展的EAE模型（圖1）。

　　2.2 DA大鼠EAE動物模型的病情變化

　　大鼠注射抗原后14 d精神萎靡、活動減少、食欲減退、體質(zhì)量逐漸下降。起病的開始癥狀為尾部張力下降，繼而尾部張力消失、單側(cè)后肢及雙側(cè)后肢無力、癱瘓，人為翻身后不能恢復姿態(tài)，嚴重者四肢癱瘓，截至觀察日期結(jié)束未出現(xiàn)死亡。實驗組大鼠于免疫后第16天左右開始發(fā)病，潛伏期（14.9 ± 0.9）d。表現(xiàn)為一次性急性發(fā)病過程，發(fā)病率為100%，平均發(fā)病時間為10 d，發(fā)病的高峰期為注射抗原后18 ～ 22 d，病情恢復較快，平均臨床評分為3.4 ± 1.1。

　　2.3 食蟹猴EAE模型病情變化

　　經(jīng)臨床病情觀察、MRI和CSF 細胞檢查發(fā)現(xiàn)，本試驗用同種型猴腦白質(zhì)勻漿致敏12只食蟹猴，全部動物于致敏5 ～ 30 d發(fā)病，主要表現(xiàn)為：精神萎靡，嗜睡，少食，體重下降，脫毛，共濟失調(diào)、肢體癱瘓。所有實驗動物均發(fā)病，病情輕重不同，臨床評分2.5 ± 1.2，無一例昏迷或死亡。發(fā)病后2月內(nèi)12只致敏的食蟹猴有3只復發(fā)，6只為急性發(fā)作型EAE，3只為慢性進展型EAE。

　　2.4 C57BL/6小鼠EAE病理特點

　　脊髓HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)脊髓的炎癥細胞浸潤嚴重，而且多數(shù)腰骶段zui重（圖2A），有血管套形成（圖2B），胸段次之，頸部較輕。腦部炎癥相對很輕，而且以腦室周圍為主。炎癥評分為2.0 ± 0.9。EAE組的脫髓鞘改變與炎癥細胞浸潤伴行，多數(shù)也以腰骶段zui重（圖2C），胸段次之，頸部較輕，腦部很輕，脫髓鞘評分為4.0 ± 0.9。軸突染色結(jié)果顯示，脫髓鞘病變嚴重的，軸突損傷也非常嚴重（圖2D），兩者也幾乎并行。

　　2.5 DA大鼠EAE動物模型的病理結(jié)果

　　2.5.1 HE染色結(jié)果 HE染色在光鏡下可見發(fā)病的DA大鼠的腦和脊髓組織中有大量炎性細胞浸潤（圖3A，B），播及小腦、腦干、腦膜下、血管間隙，小血管周圍炎癥細胞積聚，呈現(xiàn)袖套樣改變（圖4A，B），脊髓病變以腰膨大處zui明顯。病變早期有少量炎性細胞浸潤，隨病情發(fā)展，病變范圍擴大，病灶增多，在病變高峰期血管周圍有大量炎性細胞浸潤，血管套征增多，病變多位于白質(zhì)區(qū)域內(nèi)。病理變化與臨床病情嚴重程度基本一致。炎癥評分為3.5 ± 0.8。

　　2.5.2 LBF染色結(jié)果 髓鞘染色在光鏡下見EAE動物的髓鞘脫失輕微，染色淡（如圖5B）。脫髓鞘評分為2.0 ± 0.4。

　　2.6 食蟹猴EAE動物模型的病理結(jié)果

　　2.6.1 光鏡所見 HE染色：見急性EAE額、顳、頂、腦干、小腦和脊髓小靜脈周圍大量淋巴、單核細胞浸潤，格子細胞形成及小膠質(zhì)細胞呈袖套狀浸潤（圖6A），炎癥評分為3.0 ± 0.8。髓鞘染色：見明顯的脫髓鞘病灶，分布在小靜脈周圍（圖6B），腦干、小腦及視神經(jīng)未見脫髓鞘病灶，脊髓頸7，胸1后索見小灶性脫髓鞘病灶。脫髓鞘評分為2.0 ± 0.8。

　　2.6.2 電鏡所見 急性EAE顳葉深部白質(zhì)，小腦，橋腦可見到正常的髓鞘內(nèi)少突膠質(zhì)細胞（ODC）胞漿已明顯水腫。髓鞘內(nèi)板層松解和軸突髓鞘分離，而此時髓鞘外板層正常（圖6C，左側(cè)），髓鞘內(nèi)軸突完好（圖6C，右側(cè)，粗箭頭），但ODC內(nèi)水腫明顯（圖6C，右側(cè)，細箭頭），線粒體腫脹，嵴模糊或斷裂，核部分溶解。有些髓鞘均勻一致腫脹松解（圖6D，左側(cè)，細箭頭）。慢性EAE基底節(jié)區(qū)，小腦及橋腦白質(zhì)內(nèi)可見明顯的髓鞘脫失或脫落傾向，軸突明顯減少，脫髓鞘的軸突變性（圖6D，右側(cè)，粗箭頭）。

　　3 討 論

　　3.1 不同抗原的EAE特點

　　髓鞘堿性蛋白（MBP）誘發(fā)的EAE模型沒有復發(fā)緩解的病程，只有炎癥反應明顯，脫髓鞘輕微，目前認為是急性播散性腦脊髓炎的模型[9]。近來發(fā)現(xiàn)，CNS中十分微量的一種糖蛋白M2是導致EAE中脫髓鞘的關(guān)鍵成分，后來證明它是髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白（MOG）。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)針對MOG的抗體能夠在體內(nèi)和體外造成脫髓鞘，而同時給予抗MOG抗體就能夠造成進展性EAE模型[10]。除了在大鼠可造成復發(fā)型EAE，單劑注射35 ～ 55肽段MOG在小鼠也可誘發(fā)復發(fā)—緩解型MS，而在H-2b小鼠誘發(fā)慢性進展的MS[11]。它們與MBP誘發(fā)的EAE不同，但是更具有MS的特點。

　　本文用MOG 35 ～ 55誘導C57BL/6小鼠EAE，所有動物100%發(fā)病，平均發(fā)病時間（14.3 ± 1.5） d， 平均病情評分：（2.6 ± 0.8）分，zui大病情評分（3.9 ± 1.5）分，病情恢復較慢，炎癥反應輕，脫髓鞘明顯，我們認為是MS的模型。用豚鼠脊髓勻漿為抗原致敏的DA大鼠EAE所有動物14天左右100%發(fā)病，平均發(fā)病天數(shù)為10 d，發(fā)病的高峰期為注射抗原后18 ～ 22 d，病情恢復較快，炎癥反應重，脫髓鞘輕微，為急性發(fā)病過程。而用同源猴腦白質(zhì)勻漿制作食蟹猴EAE模型12只，全部動物于致敏5 ～ 30 d發(fā)病，發(fā)病后2月內(nèi)12只致敏的食蟹猴有3只復發(fā)，6只為急性發(fā)作型EAE，3只為慢性進展型EAE。因此，用同源猴腦白質(zhì)勻漿不能誘發(fā)的MS模型。

　　3.2 不同動物的EAE模型特點

　　EAE的建立不僅與致腦炎抗原和致敏方法有關(guān)，而且與動物的遺傳背景有關(guān)。經(jīng)免疫遺傳學研究發(fā)現(xiàn)EAE的發(fā)生是由遺傳控制的[12]。EAE的易感性受免疫反應基因（Ir基因）影響，Ir基因的調(diào)節(jié)作用主要表現(xiàn)為T細胞表面受體對MBP產(chǎn)生特異性免疫反應。此特異性表達的受體能與MBP的特異性致腦炎抗原決定簇連接，促使腦炎發(fā)生。動物的種類不同，其受體的表達能力不同，從而對EAE的易感性也不同。經(jīng)研究證實Lewis鼠、SJL/J鼠、猴是zui合適的研究對象。

　　3.2.1 鼠 不同種類鼠對EAE的易感性不同，Lewis鼠對EAE非常敏感，SJL/J、SWR/J種和中國的KM鼠對EAE也很敏感，而Bow-Norway、Balb/c種鼠對EAE有高度的抵抗性，研究證實后兩種鼠T細胞上缺乏對MBP反應的受體[1]。

　　用鼠作為研究對象的優(yōu)點是：其遺傳基礎研究得相當清楚、應用試劑容易得到、繁殖快、價格低廉、誘導EAE發(fā)生率高達約80%、復發(fā)率高，故適合大規(guī)模研究;并且鼠EAE無論在臨床、病理和免疫生化改變等方面與人類脫髓鞘疾病較為相似[1]。但是，鼠EAE也有不少缺點：臨床癥狀不易觀察;輔助檢查不易進行;抽血檢查外周血T淋巴細胞會影響EAE的發(fā)展;影像學研究受到影響，尤其是與人種屬差異大。

　　3.2.2 猴 不同種屬的猴對EAE的敏感性不同，其中恒河猴、食蟹猴、Callithrix Jacchus 猴對EAE非常敏感，目前國外應用較多。另外，研究發(fā)現(xiàn)MHC-DPB1等位基因是猴對EAE敏感的主要遺傳因素[12]。

　　恒河猴和食蟹猴的應用zui多，因為：誘發(fā)EAE發(fā)生率高，達90%以上，復發(fā)率也高;癥狀出現(xiàn)早，一般在致敏后6 ～ 12 d;癥狀極易觀察評價;輔助檢查和抽血檢查易進行且不影響EAE的發(fā)展;其臨床、病理、生化與免疫學改變與人類CNS脫髓鞘疾病極其相似;影像學研究不受影響，而且與人種屬差異小，藥物試驗性治療代表性大，因而其應用價值大，為研究人類MS提供了重要模型。近年來，Genain 等[13]認為非人靈長類動物和人的免疫系統(tǒng)基因具有相似性，非人靈長類EAE動物模型為MS的研究提供了非常重要的理論依據(jù)，特別在MS的影像學和探討新的治療措施方面。另外，Genain[14]用Callithrix Jacchus 猴用髓鞘加CFA免疫形成RR-EAE。他們認為這種EAE的病理與MS的脫髓鞘斑塊非常相似。而且認為自身抗體主要攻擊的靶是MBP和MOG，另外他們也認為這種猴的EAE可以使得EAE的MRI 研究成為可能，而且這種模型的研究可以加快MS的治療進展。

　　我們用SJL/J小鼠、DA大鼠和食蟹猴成功制作了EAE模型。因國外有報道[15]不同抗原在同一種動物身上不能誘發(fā)發(fā)病率高的EAE模型，因此，我們沒有做不同抗原在同一種動物身上的誘發(fā)試驗。我們認為豚鼠脊髓勻漿誘導的DA大鼠EAE動物模型為急性模型，病情恢復快，炎癥反應重，脫髓鞘輕微，是急性播散性腦脊髓炎的模型;用MOG 35 ～ 55乳化液制作C57BL/6小鼠EAE模型為慢性進展的模型，炎癥反應輕，脫髓鞘和軸突損傷明顯，是MS的模型。用同源猴腦白質(zhì)勻漿致敏的EAE食蟹猴有急性病程的，有復發(fā)的，有慢性進展型的，非常類似多發(fā)性硬化。但猴價格昂貴，繁殖慢，數(shù)量相對較少，而且檢查的試劑不容易得到，不適合大規(guī)模實驗研究，適合影像學和治療的研究。

　　總之，不同抗原和不同動物的多發(fā)性硬化動物模型無論從病程、神經(jīng)功能評分和病理改變方面均有自己的特點。用MOG 35 ～ 55乳化液制作C57BL/6小鼠EAE模型是MS的模型。

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