一般信息

本指南的目的：

C-WellTM技術(shù)指南包含有關(guān)C-WellTM細(xì)胞球體培養(yǎng)平臺(tái)的信息。本指南提供了球體形成和試劑制備的完整方案。

儲(chǔ)存和有效期：

室溫下儲(chǔ)存時(shí)，C-WellTM的有效期為36個(gè)月。

不要重復(fù)使用，否則會(huì)遇到以下問題：污染、細(xì)胞球體形成失敗和富含蛋白質(zhì)的表面。

請(qǐng)勿將C-WellTM儲(chǔ)存在紫外線輻射環(huán)境中。

預(yù)期用途：

僅供研究使用。不適用于人類或動(dòng)物的診斷或治療用途。

C孔描述TM

C-WellTM：

C-WellTM是一個(gè)革命性的細(xì)胞球體培養(yǎng)平臺(tái)，以高通量的方式生成各種類型的尺寸控制的細(xì)胞球體。使用培養(yǎng)細(xì)胞球體的技術(shù)是一種懸滴法。

每個(gè)懸滴中的環(huán)境聚集細(xì)胞，然后形成單個(gè)球體。但懸滴法有幾個(gè)局限性。懸滴法的主要局限性是：“勞動(dòng)強(qiáng)度”、“低通量”、“培養(yǎng)時(shí)間相對(duì)較短”、“無法獲得額外的新鮮生長培養(yǎng)基”和“細(xì)胞球體大小不均勻”。

與懸滴法相比，C-WellTM具有以下優(yōu)勢(shì)

任何其他商業(yè)化球體培養(yǎng)平臺(tái)：“由于易于獲得培養(yǎng)基更換，延長培養(yǎng)期10-30天”、“通過控制細(xì)胞接種密度，某些應(yīng)用的培養(yǎng)期極短，為2-3天”、“無直接細(xì)胞-細(xì)胞接觸的共培養(yǎng)準(zhǔn)備系統(tǒng)，例如Transwell小室”、“生成尺寸受控的細(xì)胞球體”、“由于無剪切應(yīng)力結(jié)構(gòu)，易于改變裝置中的生長培養(yǎng)基”、“適用于各種細(xì)胞類型”和“無限通量（一個(gè)裝置可獲得361個(gè)細(xì)胞球體）”。

方法

使用C孔制備用于細(xì)胞球體培養(yǎng)的試劑和材料TM

• 靶細(xì)胞生長培養(yǎng)基
• 胰蛋白酶/EDTA或ACCUTASETM
• 臺(tái)盼藍(lán)
• 磷酸鹽緩沖液(PBS)1X
• 70%乙醇
• 100%乙醇
• 去離子水(DDW)，可選
• 牛血清白蛋白(BSA)4%溶液，可選

使用C孔制備細(xì)胞球體培養(yǎng)設(shè)備TM

• C-WellTM
• 錐形管（15 mL或50 mL）
• T75燒瓶或細(xì)胞培養(yǎng)皿
• 細(xì)胞過濾器（100 μm孔徑）
• 皮氏培養(yǎng)皿（60 mm或100 mm，未處理）
• 血細(xì)胞計(jì)數(shù)器（例如DHC-N01、INCYTO）
• 移液器和吸頭（1 mL和200 μL）
• 血清移液器及吸頭(10 mL)
• 潔凈工作臺(tái)
• CO2培養(yǎng)箱
• 相差顯微鏡檢查
• 吸引器
• 離心機(jī)
• 酒精燈

A. C孔預(yù)處理TM 細(xì)胞接種前

1. 將生長培養(yǎng)基、1X PBS（或DDW）和100%乙醇加熱至室溫。

生長培養(yǎng)基的推薦近似體積為14 mL/1器械，1X PBS為24 mL/1器械，100%乙醇為8 mL/1器械。

2. 在超凈工作臺(tái)中拆除C-WellTM的包裝。
3. 使用無菌鑷子，從一個(gè)外緣朝向另一個(gè)外緣將C-WellTM置于60 mm培養(yǎng)皿上，以防止C-WellTM和培養(yǎng)皿之間產(chǎn)生氣泡。
4. 向制備的平皿中加入8 mL 100%乙醇。
5. 用1 mL移液器反復(fù)移液，輕輕去除微孔中的氣泡。
6. 在培養(yǎng)皿一角抽吸100%乙醇。請(qǐng)勿在每個(gè)微孔中抽吸溶液。
7. 向培養(yǎng)皿中加入8 mL 1X PBS，再次去除氣泡。
8. 在培養(yǎng)皿一角抽吸1X PBS。請(qǐng)勿在每個(gè)微孔中抽吸溶液。
9. 重復(fù)上述7、8步兩次。
10. 向培養(yǎng)皿中加入7 mL生長培養(yǎng)基，并充分去除氣泡。
11. 將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中至少24小時(shí)。
12. 用1 mL移液器反復(fù)移液，輕輕去除微孔中的氣泡。
13. 在培養(yǎng)皿一角吸出生長培養(yǎng)基，并在細(xì)胞接種前加入7 mL新鮮生長培養(yǎng)基。

B-1.靶細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備（貼壁細(xì)胞用）

1. 將生長培養(yǎng)基和適當(dāng)濃度的胰蛋白酶/EDTA溶液預(yù)熱至37 ℃。
2. 加入10 mL 1X PBS，輕輕清洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶(T75)或培養(yǎng)皿(100 mm)。
3. 吸取1X PBS溶液。
4. 加入2 mL胰蛋白酶/EDTA溶液，并將燒瓶置于37℃CO2培養(yǎng)箱中1 ~ 2 min（取決于細(xì)胞類型）。
5. 輕輕敲擊燒瓶，觀察細(xì)胞。大部分細(xì)胞應(yīng)分離
6. 用4 mL生長培養(yǎng)基或適當(dāng)?shù)闹泻腿芤褐泻鸵鹊鞍酌?EDTA處理的細(xì)胞懸液。
7. 通過反復(fù)移液*分離細(xì)胞。
8. 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量（例如INCYTO C-Chip、DHC-N01）
9. 在適當(dāng)離心力下離心細(xì)胞懸液。
10. 通過抽吸去除上清液。
11. 將細(xì)胞團(tuán)塊重懸于生長培養(yǎng)基中。細(xì)胞懸液的終接種密度和終體積應(yīng)分別為0.1 ~ 0.5 × 106個(gè)/mL和7 mL。這些值因細(xì)胞類型而異。

B-2.靶細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備（用于懸浮細(xì)胞）

1. 將生長培養(yǎng)基和適當(dāng)濃度的胰蛋白酶/EDTA溶液（可選）加熱至37 ℃。
2. 通過反復(fù)移液使細(xì)胞懸液均質(zhì)化并解聚。
3. 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量（例如INCYTO C-Chip、DHC-N01）
4. 在適當(dāng)離心力下離心細(xì)胞懸液。
5. 通過抽吸去除上清液。
6. （可選）加入1 ~ 2 mL胰蛋白酶/EDTA溶液，置于37 °C CO2培養(yǎng)箱中1 ~ 2 min（細(xì)胞類型不同）。
7. （可選）用2 ~ 4 mL生長培養(yǎng)基或適當(dāng)?shù)闹泻腿芤褐泻鸵鹊鞍酌?EDTA處理的細(xì)胞懸液（因細(xì)胞類型而異）。
8. （可選）在適當(dāng)離心力下離心細(xì)胞懸液。
9. （可選）通過抽吸去除上清液。
10. 將細(xì)胞團(tuán)塊重懸于生長培養(yǎng)基中。細(xì)胞懸液的終接種密度和終體積應(yīng)分別為0.1 ~ 0.5 × 106個(gè)/mL和7 mL。這些值因細(xì)胞類型而異。

3. 使用C-Well形成細(xì)胞球體TM
   1. 將生長培養(yǎng)基加熱至37 ℃。
   2. 用1 mL移液器反復(fù)移液，輕輕去除微孔中的氣泡。
   3. 吸出培養(yǎng)皿一角的生長培養(yǎng)基，加入7 mL細(xì)胞接種密度為0.1 ~ 0.5 × 106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液
   4. 10 ~ 15 min后（因細(xì)胞類型而異），輕輕吸出細(xì)胞懸液，除去上清液細(xì)胞。
   5. 在培養(yǎng)皿一角加入7 mL生長培養(yǎng)基。
   6. 吸出混懸液，并在培養(yǎng)皿一角加入7 mL生長培養(yǎng)基。重復(fù)該步驟兩次。確保該步驟結(jié)束時(shí)沒有懸浮細(xì)胞是非常重要的。如果不是，這些懸浮細(xì)胞可能阻礙細(xì)胞球體的形成。
   7. 培養(yǎng)皿置37 °C CO2培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。
   8. 每24小時(shí)更換一次培養(yǎng)皿中的生長培養(yǎng)基。

圖1 MCF7球體的培養(yǎng)條件。細(xì)胞接種密度和清洗時(shí)間因細(xì)胞類型而異。應(yīng)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定適當(dāng)?shù)慕臃N密度和洗滌時(shí)間。

圖2 MCF7球體的形成。

圖3 A549球體的形成。

圖4 HepG2球體的形成。